DNA sequencing

การหาลำดับเบสบนสายดีเอ็นเอเรียกว่า DNA sequencing

ในปัจจุบันมีเทคนิคสองแบบที่ใช้ทำ DNA sequencing คือ Sanger sequencing และ Next-Generation sequencing (NGS)

Sanger sequencing

Sanger sequencing ถูกพัฒนาโดย Fred Sanger และคณะในปี 1977 วิธีนี้ยังเป็นที่นิยมในการศึกษาลำดับเบสของยีนหรือลำดับเบสหนึ่ง ๆ

Sanger sequencing ใช้วิธีคล้ายกับการทำ PCR นั่นคือมีส่วนประกอบคือ

• DNA polymerase

• Primer ที่จับกับส่วนดีเอ็นเอที่สนใจ

• DNA nucleotides (dATP, dTTP, dCTP และ dGTP ที่รวมกันเรียกว่า dNTPs)

• template DNA

แต่ Sanger sequencing จะใช้ส่วนประกอบอีกอย่างเพิ่มเข้ามาจากการทำ PCR ปกติคือ ddATP, ddTTP, ddCTP และ ddGTP ที่ติดฉลากสีฟลูออเรสเซนส์ไว้เบสละสีรวมเป็นสี่สี โดย ddNTPs นี้เป็น dideoxy ที่ต่างจาก dNTPs ปกติที่เป็น deoxy และเนื่องจาก dideoxy ที่ไม่มีออกซิเจนที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 3 นี้ทำให้ DNA polymerase ไม่สามารถสร้างพันธะ phosphodiester เอานิวคลีโอไทด์ตัวต่อไปเข้ามาต่อได้

รูปที่ 8 ddNTP และ dNTP

รูปที่ 9 Sanger sequencing และกราฟที่ได้จากกระบวนการนี้ที่เรียกว่า chromatogram

รูปที่ 10 ลำดับเบสบน Chromatogram

Dideoxy nucleotides มีโครงสร้างคล้ายกับ deoxy nucleotides แต่มันไม่มีหมู่ hydroxyl ที่คาร์บอนที่ 3’ ในน้ำตาล เมื่อ dideoxy nucleotide ถูกเพิ่มเข้าไปในสายดีเอ็นเอ เพราะว่ามันไม่มีไฮดรอซิลทำให้นิวคลีโอไทด์มาเชื่อมต่ออีกไม่ได้ สายจึงหยุดอยู่เท่านั้นและเนื่องจากมันได้ติดฉลากสีเอาไว้ เมื่อนำมาอ่านจึงเห็นเป็นลำดับเบส